2023 - Mariana Nascimento de Paula

Ph.D. Dissertation

Autor/author: Mariana Nascimento de Paula

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - Universidade Estadual de Maringá

Área do Conhecimento: Farmacognosia

Data de Defesa: 06 de julho de 2023

Orientador: Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello

Banca examinadora: Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello

                            Profa. Dra. Naiara Cássia Gancedo

                            Profa. Dra. Danielle Lazarin Bidóia

                            Profa. Dra. Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal

                            Profa. Dra. Rita de Cássia Ribeiro Gonçalves

Título: Avaliação da atividade antiadesiva de extratos de Monteverdia ilicifolia frente à Helicobacter pylori

Resumo: Monteverdia ilicifolia (Mart. ex Reissek) Biral, é um membro da família Celastraceae, conhecida popularmente como espinheira-santa, cancorosa, espinheira de deus, espinheira divina, quebrachilho, salva vidas, entre outros. No Brasil é amplamente utilizada para tratamento de úlceras gástricas, sendo que em comunidades indígenas e rurais é utilizada por apresentar propriedades analgésica, antitumoral, afrodisíaca, antiespasmódica, contraceptiva, antiulcerogênica, diurética e cicatrizante. O objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade anti-H. pylori de extratos e substâncias isoladas das folhas de M. ilicifolia e atividade antiadesão in vitro, bem como a identificação dos compostos presentes no extrato semipurificado. O extrato bruto 2 (EB2) e o extrato bruto 5 (EB5) foram obtidos das folhas desengorduradas por extração com etanol: água (1:1, v/v) e acetona: água (7:3, v/v), respectivamente. Cada extrato foi ressuspenso em água e particionado com acetato de etila, resultando nas frações aquosas (FAQ2 e FAQ5) e nas frações acetato de etila (FAE2 e FAE5). A avaliação da influência dos extratos e frações na viabilidade celular de células AGS de estômago humano (ATCC CRL 1739) foi realizada pelo ensaio do MTT; a potencial atividade contra Helicobacter pylori (cepa J99, ATCC 700824) foi testada pelo ensaio de difusão em ágar e a influência do extrato na adesão bacteriana foi investigada pelo ensaio em citometria de fluxo (FACS). A caracterização química foi obtida por métodos cromatográficos como CCD, UHPLC e LC-MS. Os extratos hidroalcóolico (EB2) e hidroacetônico (EB5) das folhas de M. ilicifolia não influenciaram a proliferação bacteriana e não tiveram atividade relevante sobre a atividade mitocondrial de células AGS do estômago humano (1 a 1000 μg/mL). O ensaio de adesão por citometria de fluxo de H. pylori J99 marcado com fluorescência em células AGS indicou efeitos antiadesivos significativos de EB2 na faixa de concentração de 250 a 1000 μg/mL e uma atividade ainda mais forte foi observada para EB5 (IC₅₀ 615 μg/mL). Com relação as frações testadas, as melhores taxas de inibição foram encontradas para os compostos solúveis em água de EB5. A respectiva fração interagiu predominantemente com sistemas de adesão de H. pylori, enquanto o pré-tratamento das células AGS resultou em efeitos mais pronunciados. Estudos analíticos de LC-MS das frações mais ativas revelaram a presença de glicosídeos flavonoides e proantocianidinas oligoméricas. Considerando os resultados obtidos, pode-se sugerir o uso de M. ilicifolia como medida de profilaxia a infecção por H. pylori.

Palavras-chave: Maytenus ilicifolia, espinheira-santa, Células Gástricas, Farmacognosia, Produtos Naturais, Plantas Medicinais, Fitoquímica.

Title: Evaluation of the anti-adhesive activity of Monteverdia ilicifolia extracts against Helicobacter pylori

Abstract: Monteverdia ilicifolia (Mart. ex Reissek) Biral, is a member of the Celastraceae family, popularly known as espinheira-santa, cancorosa, espinheira de deus, espinheira divina, quebrachilho, salva vidas, among others. In Brazil it is widely used for the treatment of gastric ulcers, and in indigenous and rural communities it is used for its analgesic, antitumor, aphrodisiac, antispasmodic, contraceptive, antiulcerogenic, diuretic and healing properties. The objective of this work was to evaluate the anti-H. pylori activity of extracts and isolated compounds from M. ilicifolia leaves, and in vitro antiadhesive, as well as the identification of compounds present in the semi purified extract. Crude extract 2 (CE2) and crude extract 5 (CE5) were obtained from the degreased leaves by extraction with ethanol: water (1:1, v/v) and acetone: water (7:3, v/v), respectively. Each extract was resuspended in water and partitioned with ethyl acetate, resulting in aqueous fractions (AQF2 and AQF5) and ethyl-acetate fractions (EAF2 and EAF5). To evaluation of the extracts and fractions influence on the cell viability of human stomach AGS cells (ATCC CRL 1739), was performed the MTT assay; the potential cytotoxicity against Helicobacter pylori (strain J99, ATCC 700824) was tested by agar diffusion assay and the influence of the extract on bacterial adhesion was investigated by flow cytometry assay (FACS). Chemical characterisation was obtained by chromatographic methods as TLC, UHPLC and LC-MS. Hydroalcoholic (CE2) and hydroacetonic extracts (CE5) from M. ilicifolia leaves did not influence bacterial proliferation and had no relevant activity on the mitochondrial activity of human stomach AGS cells (1 to 1000 μg/mL). Flow-cytometric adhesion assay of fluorescent-labelled H. pylori J99 on AGS cells indicated significant anti-adhesive effects of CE2 in the concentration range of 250 to 1000 μg/mL and an even stronger activity was observed for CE5 (IC₅₀ = 615 µg/mL). Regarding the fractions tested, the best inhibition rates were found for the water-soluble compounds of CE5. The respective fraction interacted predominantly with H. pylori adhesion systems, while pre-treatment of the AGS cells resulted in more pronounced effects. Analytical LC-MS studies of the most active fractions revealed the presence of flavonoid glycosides and oligomeric proanthocyanidins. Considering the results obtained, it can be suggesting the use of M. ilicifolia as a prophylaxis measure against H. pylori infection.

Keywords: Maytenus ilicifolia, espinheira-santa, Gastric Cells, Pharmacognosy, Natural Products, Medicinal Plants, Phytochemistry.

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