2021 - Nadla Soares Cassemiro
Ph.D. Dissertation
Autor/author: Nadla Soares Cassemiro
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - Universidade Estadual de Maringá
Área do Conhecimento: Farmacognosia
Data de Defesa: 21 de outubro de 2021
Orientador: Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello
Banca examinadora: Prof. Dr. Adriano Cesar de Morais Baroni
Prof. Dra. Fernanda Oliveira das Chagas
Prof. Dra. Laila Salmen Espíndola
Prof. Dr. João Luis Callegari Lopes
Título: Biotransformação de produtos naturais e fármacos na busca de novos compostos bioativos.
Resumo: A síntese química de substâncias bioativas pode ser realizada em larga escala, porém devido a algumas desvantagens desse método outras técnicas já vêm sendo utilizadas. A biotransformação de bioativos usando microrganismos é um método alternativo, simples, de baixo custo, que confere estereoespecificidade reacional, além de ser ambientalmente seguro. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo isolar compostos de origem natural e realizar sua biotransformação, bem como de fármacos comerciais, utilizando cepas de fungos como biocatalisadores. O iridoide especiosídeo (das cascas do caule de Tabebuia aurea) e um sesquiterpeno oxigenado (do óleo essencial das partes aéreas de Bacopa gratioloides) foram isolados e estruturalmente caracterizados por ressonância magnética nuclear (RMN) e Cromatografia líquida de alta eficiência acoplado aos detectores de arranjo de diodo e espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM). Além dessas substâncias isoladas, os fármacos fluconazol, meropenem, prednisolona, metilprednisolona e clindamicina foram submetidos a reações de biotransformação utilizando os fungos Aspergillus terreus, A. niveus, A. niger, A. flavus, A. japonicus, Penicillium crustosum e Thermoascus aurantiacus. A biotransformação de todas as substâncias foi realizada em duplicata, em meio contendo K2HPO4, MgSO4. 7H2O, proteose peptona, glicose e água deionizada, a 30 ºC, sob agitação constante. Alíquotas do meio foram monitoradas por cromatografia em camada delgada (CCD) e CLAE-DAD-EM até cessar o consumo do material de partida. O óleo das partes aéreas da B. gratioloides (BGEO), constituído majoritariamente pelo sesquiterpeno oxigenado, foi avaliado quanto sua atividade deterrente alimentar e deterrente contra Anagasta kuehniella e Callosobruchus maculatus, o qual mostrou-se eficaz. Depois, esse sesquiterpeno foi isolado, identificado e além de se mostrar inédito, apresentou efeito anticâncer contra melanoma murino (B16F10-Nex2), bem como promoveu marcada inibição da migração celular in vitro e morte por apoptose. Posteriormente, esse sesquiterpeno foi biotransformado por A. niger e gerou 17 novos metabólitos por reações de hidroxilação, redução e desidrogenação. Dois desses compostos foram isolados e identificados como produtos de hidroxilação régio e estereoseletiva. Já a biotransformação do especiosídeo mediada por fungos resultou em 19 diferentes compostos. O especiosídeo na forma não glicosilada foi o principal metabólito observado. Os outros compostos foram produzidos a partir de reações de hidrólise do éster, hidroxilação, metilação e hidrogenação. Por outro lado, todos os fármacos alvos deste trabalho foram submetidos à biotransformação usando diferentes espécies de fungos e realizadas várias modificações de meio de crescimento, apesar disso, nenhum experimento levou a obtenção de nenhum derivado. Os resultados desse trabalho mostraram o BGEO como promissora fonte para o desenvolvimento de repelentes e deterrentes naturais no controle de pragas. Além disso, o sesquiterpeno isolado deste óleo é inédito e apresentou atividade anticâncer in vitro. Sua biotransformação, por sua vez, foi muito eficiente, gerando moléculas inéditas e promissoras anticâncer. Por fim, a biotransformação por fungos mostrou-se uma técnica muito eficiente para os compostos naturais, com alta especificidade, capaz de produzir derivados a partir de variados tipos de reações, e também de compostos que não foram possíveis se obter por síntese química.
Palavra-chave: Bacopa gratioloides, Aspergillus sp, sesquiterpeno, especiosídeo não glicosilado, hidroxilação, anticâncer.
Title: Biotransformation of natural products and drugs in the search for new bioactive compounds.
Abstract: The chemical synthesis of bioactive substances can be performed on a large scale, but due to some disadvantages of this method, other techniques are already being used. Bioactive biotransformation using microorganisms is an alternative, simple, low-cost method, which confers reactional stereospecificity, in addition to being environmentally safe. Thus, this work aimed to isolate compounds of natural origin and perform their biotransformation, as well as commercial drugs, using fungal strains as biocatalysts. The speciosid iridoide (from the bark of Tabebuia aurea) and an oxygenated sesquiterpene (from the essential oil of the aerial parts of Bacopa gratioloides) were isolated and structurally characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) and high performance liquid chromatography coupled to array detectors diode and mass spectrometry (HPLC-DAD-MS). In addition to these isolated substances, the drugs fluconazole, meropenem, prednisolone, methylprednisolone and clindamycin were submitted to biotransformation reactions using the fungi Aspergillus terreus, A. niveus, A. niger, A. flavus, A. japonicus, P. crustosum and Thermoascus aurantiacus. The biotransformation of all substance was performed in duplicate, in medium containing K2HPO4, MgSO4. 7H2O, proteose peptone, glucose (0.609 g) and deionized water (50 mL), at 30 ºC, under constant agitation (110 rpm). Aliquots of the medium were monitored by thin layer chromatography (TLC) and HPLC-DAD-MS until consumption of starting material ceased. The oil from the aerial parts of B. gratioloides (BGEO), mainly constituted by oxygenated sesquiterpene, was evaluated for its food deterrent and deterrent activity against Anagasta kuehniella and Callosobruchus maculatus, which proved to be effective. Afterwards, this sesquiterpene was isolated, identified and, in addition to being unprecedented, it showed an anticancer effect against murine melanoma (B16F10-Nex2), as well as promoted a marked inhibition of cell migration in vitro and death by apoptosis. Subsequently, this sesquiterpene was biotransformed by A. niger and generated 17 new metabolites by hydroxylation, reduction and dehydrogenation reactions. Two of these compounds were isolated and identified as regio- and stereoselective hydroxylation products. The fungal-mediated biotransformation of the specioside resulted in 19 different compounds. Specioside in non-glycosylated form was the main metabolite observed. The other compounds were produced from ester hydrolysis, hydroxylation, methylation and hydrogenation reactions. On the other hand, all target drugs of this work were submitted to biotransformation using different species of fungi and carried out several modifications of the growth medium, despite this, no experiment led to obtaining any derivative. The results of this work showed BGEO as a promising source for the development of repellents and natural detergents for pest control. Furthermore, the sesquiterpene isolated from this oil is new and showed anticancer activity in vitro. Its biotransformation, in turn, was very efficient, generating novel and promising anticancer molecules. Finally, biotransformation by fungi proved to be a very efficient technique for natural compounds, with high specificity, capable of producing derivatives from various types of reactions and compounds that were not possible to obtain by chemical synthesis.
Keywords: Bacopa gratioloides, Aspergillus sp, non-glycosylated specioside, hydroxylation, anticancer.
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