2021 - Mariane Roberta Ritter
Ph.D. Dissertation
Autor/author: Mariane Roberta Ritter
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - Universidade Estadual de Maringá
Área do Conhecimento: Farmacognosia
Data de Defesa: 26 de março de 2021
Orientador: Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello
Banca examinadora: Prof. Dra. Daniela Cristina de Medeiros Araújo
Prof. Dra. Érika Seki Kioshima Cotica
Prof. Dra. Renata Longhini
Prof. Dra. Rita de Cássia Ribeiro Gonçalves
Título: Atividade antimicrobiana dos extratos de Trichilia catigua contra Helicobacter pylori e espécies de Candida de relevância clínica.
Resumo: Trichilia catigua A. Juss. (Meliaceae), popularmente conhecida como catuaba, é utilizada tradicionalmente como estimulante sexual, tratamento para estresse, déficit de memória e antimicrobiano. A Helicobacter pylori é uma bactéria que está presente na mucosa estomacal de mais de 50% da população mundial e está associada com o desenvolvimento de gastrite, úlceras e câncer gástrico. Infecções por leveduras do gênero Candida contabilizam mais de 400.000 casos anuais em todo o mundo, e mortalidade que se aproxima de 40% nas UTIs. O objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade in vitro e in silico dos extratos e substâncias isoladas de T. catigua contra H. pylori e leveduras do gênero Candida de importância clínica. Primeiramente o extrato bruto (EB) foi preparado a partir das cascas de T. catigua, e posteriormente particionado originando as frações aquosa (FAQ) e acetato de etila (FAE). Então a FAE foi caracterizada por eletroforese capilar e CLAE, com a quantificação dos marcadores fitoquímicos cinchonaínas Ia, Ib, IIb, epicatequina (Epi) e procianidina B2 (PB2). Após foi avaliada a citotoxicidade dos extratos e substâncias em linhagem HeLa, Vero e Macrófagos J774. A atividade contra H. pylori foi avaliada por meio de determinação da concentração inibitória mínima (CIM), inibição da enzima urease, sinergismo com claritromicina e amoxicilina, PCR em tempo real, microscopia eletrônica de varredura (MEV), e simulações por docking molecular. A avaliação de atividade anti-Candida foi realizada com cepas de C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata e C. krusei, por determinação de CIM, sinergismo das substâncias entre si e com anfotericina B e Caspofungina, e também docking molecular. Os extratos não apresentaram toxicidade para as linhagens celulares avaliadas. Em relação à atividade contra H. pylori, melhores resultados foram observados para FAE, com CIM50 de 0,25 mg/mL com 42,34% de inibição da urease, também apresentando sinergismo com claritromicina. Em nível molecular, reduziram a expressão dos genes de virulência VacA e CagA. No MEV foi possível observar que a FAE converteu as células de H. pylori para forma de cocos não viáveis e reduziu formação de biofilme. As simulações por docking sugeriram que o sinergismo entre cinchonaína Ia e Epi podem causar interação na síntese de ácidos graxos essenciais. Na atividade contra cepas de Candida, melhores resultados foram observados para FAE e cinchonaínas contra C. glabrata, com CIM de 9,76 e 3,9 μg/mL, respectivamente. Na avaliação de sinergismo, cinchonaína Ib e Epi apresentaram atividade fortemente sinérgica entre si e com Caspofungina, que também foi sinérgica com FAE. A PB2 de forma isolada e em combinação com Epi, apresentou atividade fortemente sinérgica com Anfotericina B. As análises por docking apontaram que as substâncias de catuaba atuam na interferência de atividades metabólicas essenciais de C. glabrata. As compilações dos resultados indicam que a FAE e substâncias isoladas de T. catigua apresentam potencial para desenvolvimento de novas estratégias de tratamento contra H. pylori e Candida spp.
Palavra-chave: Plantas medicinais, cinchonaínas, PCR em tempo real, Microscopia Eletrônica, Docking molecular.
Title: Antimicrobial activity of Trichilia catigua extracts against Helicobacter pylori and Candida species of clinical relevance.
Abstract: Trichilia catigua A. Juss. (Meliaceae), popularly known as catuaba, is traditionally used as a sexual stimulant, treatment for stress, memory deficit and antimicrobial agent. Helicobacter pylori is a bacterium that is present in the stomach mucosa of more than 50% of the world population and is associated with the development of gastritis, ulcers and gastric cancer. Yeast infections of the genus Candida account for more than 400,000 annual cases worldwide, and mortality that approaches 40% in ICUs. The aim of this work was to evaluate the in vitro and in silico activity of extracts and isolated componds from T. catigua against H. pylori and yeasts of the genus Candida of clinical importance. First, the crude extract (CE) was prepared from the barks of T. catigua, and later partitioned giving rise to the aqueous (AQF) and ethyl acetate fractions (EAF). Then the EAF was characterized by capillary electrophoresis and HPLC, with the quantification of the phytochemical markers cinchonain Ia, Ib, IIb, epicatechin (Epi) and procyanidin B2 (PB2). After that, the cytotoxicity of extracts and componds was evaluated in HeLa, Vero and Macrophages J774 cell lines. The activity against H. pylori was assessed by determining the minimum inhibitory concentration (MIC), inhibition of the urease enzyme, synergism with clarithromycin and amoxicillin, real-time PCR, scanning electron microscopy (SEM), and simulations by molecular docking. The evaluation of anti-Candida activity was performed with C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata and C. krusei strains, by MIC determination, synergism of the compounds among themselves and with amphotericin B and Caspofungin, and also molecular docking. The extracts showed no toxicity for the cell lines evaluated. Regarding the activity against H. pylori, better results were observed for EAF, with MIC50 of 0.25 mg/mL with 42.34% of urease inhibition, also showing synergism with clarithromycin. At the molecular level, they reduced the expression of the VacA and CagA virulence genes. In SEM, it was possible to observe that EAF converted the H. pylori cells to non-viable cocci and reduced biofilm formation. The docking simulations suggested that the synergism between cinchonaína Ia and Epi may cause interaction in the synthesis of essential fatty acids. In the activity against Candida species, better results were observed for EAF and cinchonaines against C. glabrata, with MIC of 9.76 and 3.9 μg/mL, respectively. In the assessment of synergism, cinchonain Ib and Epi showed strongly synergistic activity with each other and with Caspofungin, which was also synergistic with EAF. PB2 isolated and in combination with Epi, showed strongly synergistic activity with Amphotericin B. The docking analysis showed that the catuaba compounds act in the interference of essential metabolic activities of C. glabrata. The compilations of the results indicate that the EAF and isolated compounds from T. catigua have potential to develop new strategies of treatment against H. pylori and Candida spp.
Keywords: Medicinal plants, cinchonain, Real time PCR, Electron Microscopy, Molecular Docking.
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