2019 - Ana Luiza Sereia

Ph.D. Dissertation

Autor/author: Ana Luiza sereia

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - Universidade Estadual de Maringá

Área do Conhecimento: Farmacognosia

Data de Defesa: 15 de Abril de 2019

Orientador: Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello

Banca examinadora: Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura

                            Prof. Dr. Mário Sérgio Mantovani

                            Profa. Dra. Renata Longhini

                            Profa. Dra. Rúbia Maria Monteiro Weffort de Oliveira

Título: Avaliação in vitro dos efeitos protetores de extratos vegetais contra toxicidade induzida por βA_25-35 em células SH-SY5Y. 

Resumo: A doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência e, até o momento, não possui cura. Os produtos naturais podem ser uma potencial fonte de novas alternativas terapêuticas. Estratégias terapêuticas que diminuem o stress oxidativo, modulam o acúmulo e toxicidade da beta-amiloide (βA) e inibem a hiperfosforilação da proteína tau são procuradas para prevenir o desenvolvimento e a progressão da DA. O objetivo deste estudo foi triar os extratos bruto (EBs) e as frações acetato de etila (FAEs) de Guazuma ulmifolia, Limonium brasiliense, Paullinia cupana, Poincianella pluviosa, Stryphnodendron adstringens e Trichilia catigua utilizando bioensaios preliminares in vitro (inibição da acetilcolinesterase, atividade antioxidante e teor de polifenóis totais). Ferramentas quimiométricas foram aplicadas para selecionar os extratos/frações com maior potencial e avaliar seus efeitos protetores contra a toxicidade induzida pela βA_25-35 em células SH-SY5Y pelo ensaio do metil-tiazol-tetrazólio (MTT). Os efeitos da FAE de S. adstringens no potencial da membrana mitocondrial, produção de superóxidos, e peroxidação lipídica foram avaliados utilizando os ensaios com rodamina 123 (Rh123), 2',7'-diclorodihidrofluoresceína diacetato (H₂DCFDA) e difenil-1-pirenilfosfina (DPPP), respectivamente. A ação da FAE de S. adstringens na expressão do mRNA de 10 genes relacionados à DA (A2M, ACHE, ADAM10, APOE, APP, GSK3β, LRP1, MAPT, PSEN1 e PSEN2) foi avaliada pela reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (RT-qPCR), e os perfis eletroforéticos das FAEs de G. ulmifolia, L. brasiliense, P. cupana, P. pluviosa, e S. adstringens foram estabelecidos por eletroforese capilar. A análise de componentes principais (ACP) e a análise de agrupamento hierárquico (AAH) dividiu os extratos/frações em quatro grupos. O pré-tratamento com as FAEs agrupadas no cluster 1 (S. adstringens, P. pluviosa e L. brasiliense) protegeu as células SH-SY5Y da toxicidade induzida pela βA_25-35, sugerindo a atividade neuroprotetora dessas frações. A FAE de S. adstringens a 15,62 µg/mL foi capaz de inibir completamente a despolarização mitocondrial (69%), produção de superóxidos (49%) e peroxidação lipídica (35%) induzidas pela βA_25-35. A FAE de S. adstringens também preveniu a superexpressão do mRNA do gene MAPT (razão de expressão de 2,387x) induzida pela βA_25-35, o que pode estar relacionado a hiperfosforilação da proteína tau. Com relação ao desenvolvimento analítico, as metodologias desenvolvidas para as FAEs de G. ulmifolia, L. brasiliense, P. cupana, P. pluviosa, e S. adstringens são mais rápidas, econômicas e menos poluentes que os métodos equivalentes previamente estabelecidos por cromatografia líquida de alta eficiência, e podem ser adotadas para a rotina de controle de qualidade após adequada validação. Esta é a primeira vez que os efeitos neuroprotetores das FAEs de S. adstringens, P. pluviosa e L. brasiliense foram demonstrados e que os perfis eletroforéticos para as FAEs de G. ulmifolia, L. brasiliense, P. pluviosa, e S. adstringens foram estabelecidos. Este estudo expande o conhecimento sobre os efeitos protetores in vitro e controle de qualidade das frações avaliadas.

Palavras-chave: Atividade neuroprotetora, Beta-amiloide, Células SH-SY5Y, Doença de Alzheimer, Espécies vegetais brasileiras.

Title: In vitro evaluation of the protective effects of plant extracts against Aβ_25-35 induced cytotoxicity in SH-SY5Y cells. 

Abstract: Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia and, to date, there is no cure. Natural products can be a potential source of new therapeutic alternatives. Therapeutic strategies focusing on the reduction of oxidative stress, modulation of amyloid-beta (Aβ) toxicity and inhibition of tau protein hyperphosphorylation are warranted to avoid the development and progression of AD. The aim of this study was to screen the crude extracts (CEs) and ethyl-acetate fractions (EAFs) of Guazuma ulmifolia, Limonium brasiliense, Paullinia cupana, Poincianella pluviosa, Stryphnodendron adstringens and Trichilia catigua using preliminary in vitro bioassays (acetylcholinesterase inhibition, antioxidant activity, and total polyphenol content). Chemometric tools were applied to select extracts/fractions with greater potential and assess their protective effects against Aβ_25-35 toxicity in SH-SY5Y cells by the methyl thiazol tetrazolium (MTT) assay. The effects of the EAF of S. adstringens on mitochondrial membrane potential, superoxide production, and lipid peroxidation were evaluated using rhodamine 123 (Rh123), 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H₂DCFDA), and diphenyl-1-pyrenylphosphine (DPPP) probe, respectively. The action of the EAF of S. adstringens on the mRNA expression of 10 genes related to AD (A2M, ACHE, ADAM10, APOE, APP, GSK3β, LRP1, MAPT, PSEN1 and PSEN2) was evaluated by real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-qPCR), and the electropherogram fingerprints of EAFs of G. ulmifolia, L. brasiliense, P. cupana, P. pluviosa, and S. adstringens were established by capillary electrophoresis. Principal component analysis (PCA) and hierarchical cluster analysis (HCA) divided extracts/fractions into four clusters. Pretreatment with the EAFs grouped in cluster 1 (S. adstringens, P. pluviosa and L. brasiliense) protected SH-SY5Y cells from Aβ_25-35-induced toxicity, which suggests the neuroprotective activity of these fractions. The EAF of S. adstringens at 15.62 μg/mL was able completely to inhibit the mitochondrial depolarization (69%), superoxide production (49%) and Aβ_25-35-induced lipid peroxidation (35%). The EAF of S. adstringens also prevented the MAPT mRNA overexpression (expression ratio of 2.387x) induced by Aβ_25-35, which may be related to tau protein hyperphosphorylation. With respect to analytical development, the developed methodologies for the EAFs of G. ulmifolia, L. brasiliense, P. cupana, P. pluviosa, and S. adstringens are faster, more economical and less polluting than the equivalent methods previously established by high performance liquid chromatography, and can be adopted for quality control routine after adequate validation. This is the first time that the neuroprotective effects of the EAFs of S. adstringens, P. pluviosa, and L. brasiliense have been demonstrated and that the electropherogram fingerprints for the EAFs of G. ulmifolia, L. brasiliense, P. pluviosa and S. adstringens have been established. The study expands knowledge of the in vitro protective effects and quality control of the evaluated fractions.

Keywords: Aβ_25-35-induced toxicity, Alzheimer’s disease, Brazilian herbal species, Neuroprotective activity, SH-SY5Y cell line.

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