2016 - Andressa Blainski
Ph.D. Dissertation
Autor/author: Andressa Blainski Pinha
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - Universidade Estadual de Maringá
Área do Conhecimento: Farmacognosia
Data de Defesa: 20 de outubro de 2016
Orientador: Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello
Banca examinadora: Prof. Dr. Andreas Hensel
Proaf. Dra. Denise Brentan da Silva
Prof. Dr. Galdino Andrade Filho
Profa. Dra. Mara Lane Carvalho Cardoso
Título: Controle de Qualidade Farmacognóstico com Análise Cromatográfica Quantitativa, Planejamento Estatístico de Misturas com Avaliação Antibacteriana e Estudos Fitoquímicos de Limonium brasiliense (Baicuru).
Resumo: Limonium brasiliense (Boiss.) Kuntze (Plumbaginaceae), conhecida como baicuru, é uma planta nativa do litoral sul do Brasil e da região do rio da Prata. Seus rizomas são empregados principalmente no tratamento de tensão pré-menstrual, distúrbios menstruais e infecções geniturinário. Estudos prévios reportam a presença de substâncias fenólicas, taninos e flavonoides, em grande concentração no gênero Limonium. Os últimos trabalhos revelam efeito do tipo antiestrogênico em ratas Wistar imaturas e baixa toxicidade em modelos de estudos não clínicos (in vivo em ratos Wistar). Pelo presente trabalho, dados de controle de qualidade farmacognóstico de três diferentes coletas foram comparados a fim de colaborar com a determinação de parâmetros de qualidade mínimos para esta espécie. Foram analisados parâmetros farmacopeicos e não farmacopeicos, tais como: granulometria dos pós (d50=0,21 a 0,48 mm), perda por dessecação (11,1% a 12,4%), cinzas totais (4,9% a 5,7%), resíduo seco por extração com acetona:água (7:3, v/v) (30,6% a 39,5%), teor de polifenóis totais (8,5% a 15,8%) e perfil cromatográfico por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O extrato bruto, assim como as frações acetato de etila e aquosa demonstraram potencial antioxidante (IC50 = 6,87, 5,91 e 6,92 μg/mL, respectivamente). O perfil cromatográfico foi obtido por cromatografia em camada delgada, assim como por CLAE a partir de método desenvolvido e validado para a separação de polifenóis e quantificação de galocatequina (GC) e epigalocatequina (EGC) na fração acetato de etila. Os dados mostraram que o método analítico é específico, preciso e exato. O planejamento estatístico de misturas (centroide simplex) para avaliar a influência dos solventes de extração (água, metanol, acetona e etanol) demonstrou, considerando os dados do experimento confirmatório realizado com extração acetona água (7:3, v/v), que modelos estatísticos podem ser utilizados para prever a quantidade de polifenóis totais e GC de qualquer mistura desses quatro solventes. Entretanto, para resíduo seco, não foi possível determinar um modelo preditivo mesmo após avaliação do modelo cúbico completo e, para EGC, os dados mostram maior seletividade (cerca de 20 vezes) da água para fenóis de menor massa molecular. Os resultados demonstram uma variedade de respostas: o maior teor de resíduo seco foi para a mistura ternária água:acetona:etanol (36,6%±0,96 [2,6%]); para teor de polifenóis totais foi a mistura primária acetona pura (37,5%±0,46 [1,2%]) e a água pura apresentou o maior teor de GC e EGC (7,9%±0,39 [5,0%] e 19,6%±0,69 [3,5%], respectivamente). A análise de componente principal e análise de agrupamento hierárquica dos cromatogramas foram prejudicadas pelo deslocamento do tempo de retenção de alguns picos, entretanto as análises do espectro de ultravioleta de cada pico do cromatograma indica a presença homogênea de flavan-3-ols característicos de taninos. A análise por espectrometria de massas (LC-DAD-MS) confirmou a presença de ácido gálico, galocatequina, epigalocatequina, e prodelfinidinas-galato. Os extratos brutos, assim como as frações acetato de etila de cada um deles, produzidos pelo centroide simplex foram testados quanto ao potencial antibacteriano in vitro contra cepas de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), Enterococcus faecium resistente a vancomicina (VREfm) e Klebsiella pneumoniae produtora de carbapenemase (KPC). As frações acetato de etila apresentaram maior potencial do que os extratos brutos, em especial as obtidas a partir da mistura ternária água:acetona:etanol contra VREfm (MIC = 19 μg/mL) e a partir de metanol:acetona:etanol contra MRSA (MIC = 39 μg/mL). A atividade moderada foi notada contra KPC (MIC = 625 μg/mL) com diferentes amostras. O estudo fitoquímico possibilitou o isolamento e identificação de substâncias fenólicas, tais como miricetina-3-O-α-L-ramnosídeo, miricetina-3-O-β-D-galactosideo-6̎-galato, galocatequina, epigalocatequina, epigalocatequina-3-O-galato, epigalocatequina-3-O-galato-(4β→8)-epigalocatequina-3-O-galato e monômeros e dímeros do tipo B duplamente ligados, como epigalocatequina-3-O-(2'→O→4")-galato, epigalocatequina-3-O-(2'→O→3")-galato (4β→8) epigalocatequina-3-O-galato e samarangenina B.
Palavras-chave: Limonium brasiliense, CLAE/UV-Vis, centroide simplex, bactérias multi-resistentes, RMN de taninos, controle farmacognóstico.
Title: Pharmacognostic Quality Control with Quantitative Chromatographic Analyses, Statistical Mixture Design with Antibacterial Evaluation and Phytochemical Study of Limonium brasiliense (Baicuru).
Abstract: Limonium brasiliense (Boiss.) Kuntze (Plumbaginaceae), known as baicuru, is a native plant of the south coast of Brazil and the region of Rio da Prata. Its rhizomes are employed mainly in the treatment of premenstrual syndrome, menstrual disorders and genitourinary infections. Previous studies have reported a large concentration of the phenolic compounds, tannins and flavonoids in the genus Limonium. The latest works show antiestrogen effect in immature female rats and low toxical effect in non-clinical models. In present work, pharmacognostic quality control data from three different materials were compared in order to collaborate with the determination of minimum quality parameters for this species. It was analyzed pharmacopoeial and non- pharmacopoeial parameters such as: particle size (d50 = 0.21 to 0.48 mm), loss on drying (11.1% to 12.4%), total ash (4.9% to 5.7%), dry residue from acetone:water (7:3, v/v) extract (30.6% to 39.5%), total polyphenol content (8.5% to 15.8%) and chromatographic fingerprint by high performance liquid chromatography (HPLC). The crude extract and its ethyl acetate and aqueous fractions shown a good antioxidant potential (IC50 = 6.87, 5.91 and 6.92 μg/mL, respectively). The chromatographic fingerprint was obtained by thin-layer chromatography and by HPLC from a developed and validated method for the separation of polyphenols and quantification of gallocatechin (GC) and epigallocatechin (EGC) in ethyl acetate fraction. The analytical method was specific, precise and accurate. The statistical mixture design (simplex centroid) evaluated the influence of the solvents (water, methanol, acetone and ethanol). A confirmatory experiment was tested with acetone:water (7:3, v/v). Statistical models can be used to predict the total polyphenols and GC content. For dry residue, it was not possible to determine a predictive model even after testing the full cubic model. For EGC, there is a higher (about 20 fold) selectivity of water for phenols of lower molecular weight. The simplex centroid results showed variety response: the highest dry residue was provided for water:acetone:ethanol mixture (36.6%±0.96 [2.6%]), polyphenols content for pure acetone (37.5%±0.46 [1.2%]) and gallo- and epigallocatechin for pure water (7.9%±0.39 [5.0%] and 19.6%±0.69 [3.5%], respectively). Principal component and hierarchical clustering analysis of the chromatographic fingerprints were disturbed by displacement retention time of some peaks, but the ultraviolet spectra from each peaks indicate the presence homogeneously of flavan-3-ols characteristic to tannins. The mass spectrometry analysis (LC-DAD-MS) confirmed the presence of gallic acid, gallocatechin, epigallocatechin and prodelphinidins gallate. Besides, the extracts produced by simplex centroid were tested for activity against to Vancomycin Resistant Enterococcus faecium (VREfm), Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)-producing K. pneumoniae. The ethyl acetate fractions showed better potential than crude extracts, in special from the ternary extracts of water:acetone:ethanol against VREfm (19 μg/mL) and of methanol:acetone:ethanol against MRSA (39 μg/mL). A moderate activity was noted against KPC from different ethyl acetate fractions (625 μg/mL). The phytochemistry study enabled the isolation and identification of phenolic substances, such as myricetin-3-O-α-L-rhamnoside, myricetin-3-O-β-D-galactoside-6̎-gallate, gallocatechin, epigallocatechin, epigallocatechin-3-O-gallate, epigallocatechin-3-O-gallate-(4β→8)-epigallocatechin-3-O-gallate and monomers and B-Type dimers with doubly bonded structures as epigallocatechin-3-O-(2'→O→4")-gallate, epigallocatechin-3-O-(2'→O→3")-gallate (4β→8) epigallocatechin-3-O-gallate and samarangenin B.
Keywords: Limonium brasiliense, HPLC/UV-Vis, simplex centroid, multidrug-resistant bacteria, NMR of tannins, pharmacognostic control.
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