2014 - Fernanda Giacomini Bueno
Ph.D. Dissertation
Autor/author: Fernanda Giacomini Bueno
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - Universidade Estadual de Maringá
Área do Conhecimento: Farmacognosia
Data de Defesa: 05 de dezembro de 2014
Orientador: Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello
Banca examinadora: Prof. Dra. Francine Guimarães Baesso
Prof. Dra. Luzmarina Hernandes
Prof. Dr. Andréia Cristina Conegero Sanches
Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho
Título: Poincianella pluviosa: Estudo da viabilidade celular e proliferação de fibroblastos e queratinócitos in vitro, e avaliação da atividade cicatrizantes em ratos diabéticos e normoglicêmicos
Resumo: A cicatrização de feridas é um processo dinâmico e complexo que devido a doenças como o diabetes mellitus pode ser prejudicado. Devido aos elevados custos e diminuição da qualidade de vida das pessoas, a busca de novas drogas para acelerar o processo de cura tem se destacado. Este trabalho objetivou avaliar a atividade cicatrizante do extrato bruto (EB) de Poincianella pluviosa e suas subfrações em um modelo de estudo bioguiado in vitro, assim como sua ação em feridas cutâneas de ratos normoglicêmicos e diabéticos. No estudo bioguiado in vitro foi avaliada a viabilidade e proliferação celular de queratinócitos (HaCaT) e fibroblatos (pNDHF), e a fração com atividade foi caracterizada por 13C RMN de sólidos e LC-MS/MS. A atividade cicatrizante em ratos normoglicêmicos foi avaliada aos 4, 7, 10 e 14 dias de tratamento com gel contendo 1% do EB através do comprimento e espessura da superfície re-epitelizada, da análise de permeação cutânea pela técnica de espectroscopia fotoacústica (PAS), da quantidade de células em metáfases, e fibras colágenas (tipo I e III) e da quantificação de proteínas (fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), ciclooxigenase 2 (COX-2) e superóxido dismutase 2 (SOD-2)). A atividade cicatrizante em ratos diabéticos foi avaliada aos 4, 7, 10, 14 e 21 dias com o mesmo gel através da determinação do comprimento e espessura da superfície re-epitelizada e também pela quantificação de proteínas. Os estudos in vitro mostraram que o EB e a subfração FC1 estimularam a atividade mitocondrial em ambos os tipos de células e a proliferação de queratinócitos. A caracterização da subfração FC1 mostrou a presença de polifenóis e taninos hidrolizáveis. A avaliação da ação do gel contendo 1% de EB em ratos normoglicêmicos mostrou migração de queratinócitos no dia 4 e sua proliferação nos dias seguintes, com uma quantidade significativamente (p>0.005) aumentada de células em metáfase aos 7 dias de tratamento. As fibras colágenas do tipo I foram formadas mais rapidamente no tratamento com EB. A PAS mostrou que houve permeação do EB através da pele. Em relação às proteínas, o VEGF foi estimulado aos 4 dias e SOD-2 e COX-2 aos 7 dias. Os resultados sugerem que o EB promoveu a regulação das proteínas e a angiogênese precoce e também contribuiu para acelerar os processos envolvidos na cicatrização. Isto levou a um aumento na superfície re-epitelizada, com proliferação mitótica significativa. A maturação das fibras colágenas foi aumentada, o que poderia influenciar a resistência da matriz extracelular. Tendo em vista os resultados obtidos o EB de P. pluviosa apresenta potencial para tornar-se um produto fitoterápico promissor com uma função de cura.
Palavras-chave: Poincianella pluviosa, queratinócitos e fibroblastos in vitro, cicatrização de feridas in vivo, ratos normoglicêmicos e diabéticos.
Title: Poincianella pluviosa: Study of cell viability and proliferation of fibroblasts and keratinocytes in vitro, and evaluation of cicatrizant activity in diabetic and normoglycemic rats
Abstract: Wound healing is a dynamic and complex process that due to diseases such as diabetes mellitus may have an impaired tissue repair. Due to the high costs and decreased life quality, the search for new drugs to improve the healing process has been outstanding. This research aimed to evaluate the wound healing activity of the crude extract (CE) of Poincianella pluviosa and subfractions through bioguided study with in vitro model, as well as the action on wounds skin in normoglycemic and diabetic rats. In the bioguided study, in vitro cell viability and proliferation of keratinocytes (HaCaT) and fibroblasts (pNDHF) were evaluated, and the fraction with activity was characterized by solid 13C NMR and s LC-MS/MS. The healing activity was measured in normoglycemic mice at 4, 7, 10 and 14 days of treatment with the gel containing 1% EB by evaluating the length and thickness of the re-epithelialized surface of skin, cutaneous permeation analysis by photoacoustic spectroscopy technique (PAS), number of cells in metaphase and collagen fibers (type I and III) and quantification of proteins (vascular endothelial growth factor (VEGF), cyclooxygenase 2 (COX-2) and superoxide dismutase 2 (SOD-2)). The healing activity in diabetic rats was evaluated at 4, 7, 10, 14 and 21 days with the same gel by evaluating the length and thickness of the reepithelialized surface and quantification of proteins. In vitro evaluations have shown that CE and subfraction FC1 stimulated mitochondrial activity in both types of cells and the proliferation of keratinocytes. The characterization of subfraction FC1 showed the presence of polyphenols and hydrolysable tannins. The evaluation of the effect of the gel containing 1% CE in normoglycemic mice reveladed migration of keratinocytes on day 4 and their proliferation in the following days, with a significantly (p<0.005) increased amount of cells in metaphase after 7 days of treatment. The collagen type I fibers were formed more rapidly on treatment with CE. PAS showed that there was CE permeation through the skin. With relation to the proteins, VEGF was stimulated at day 4 and SOD-2 and COX-2 at day 7. The results suggest that CE promoted the regulation of proteins, early angiogenesis and contributed to accelerate the processes involved in wound healing. This led to an increase in re-epithelialized surface with significant mitotic proliferation. The maturation of collagen fibers was increased, which could influence the strength of the extracellular matrix. Accordingly, the results obtained from P. pluviosa crude extract might become an efficient and promising herbal for enhancing the wound healing process.
Keywords: Poincianella pluviosa, in vitro keratinocytes and fibroblasts, in vivo wound healing, normoglycemic and diabetic rats.
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