2022 - Thalita Prates de Silva
MSc. Thesis
Autor/author: Thalita Prates da Silva
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - Universidade Estadual de Maringá
Data de Defesa: 04 de outubro de 2022
Orientador: Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello
Banca examinadora: Profa. Dra. Danielle Lazarin Bidóia
Profa. Dra. Fernanda Giacomini Bueno
Título: Avaliação in vitro de extratos de Limonium brasiliense em modelo de Parkinson induzido por rotenona em células SH-SY5Y
Resumo: A Doença de Parkinson (DP) é uma doença crônica e progressiva que acomete milhões de pessoas pelo mundo, não existindo tratamento de cura ou retardo, somente medicamento que agem nos sintomas da doença. O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro a citotoxicidade e citoproteção de extratos do rizoma de Limonium brasiliense (Plumbaginaceae), utilizando linhagem de neuroblastoma humano SHSY5Y em modelo de doença de Parkinson. A partir do extrato bruto (EB) produzido com o rizoma de L. brasiliense foi preparado a fração acetato de etila (FAE) e fração aquosa (FAQ). A avaliação in vitro do efeito citotóxico da rotenona, e citoprotetor dos extratos foram realizados utilizando células de neuroblastoma humano, por meio da técnica de MTT, a detecção de espécies reativas de oxigênio (EROs) totais foi determinada com H2DCFDA, a integridade da membrana foi determinada por iodeto de propídeo (IP), a determinação do potencial transmembrânico mitocondrial determinado por Rodamina 123 (Rh 123) e avaliação dos níveis de ATP intracelular com Kit Cell Titer-Glo. A análise estatística foi realizada usando o software GraphPad Prism 9. Na avaliação de citotoxicidade, a rotenona demostrou reduzir significativamente a viabilidade celular nas concentrações testadas (500, 1000, 1500 e 2000 nM), sendo que 1702,11 nM foi a concentração necessária para causar morte em 50% da população celular e utilizada para os testes de citoproteção. O EB e frações, nas concentrações 1,95, 3,90 e 7,81 μg/mL, foram capazes de exercer proteção para a linhagem neuroblastoma SH-SY5Y frente aos danos causados pela rotenona, de forma significativa. Além disso, foi possível determinar que o EB e as frações reduziram significativamente a produção de EROs totais quando comparados com a rotenona, além de reduzir a despolarização da membrana e manter a integridade celular. Em contrapartida, as amostras não tiveram capacidade de aumentar os níveis de ATP reduzidos por rotenona. Assim, a cadeia transportadora de elétrons ligada a produção de energia não seria um possível alvo. Os tratamentos avaliados foram capazes de inibir o dano às células causado pela rotenona, devido a ação antioxidante diminuindo EROs. Esses resultados são satisfatórios no contexto da investigação de opções terapêuticas para o tratamento da DP. Porém são necessários estudos complementares de interação dos extratos com alguma proteína da membrana mitocondrial que impede a despolarização da membrana e abertura dos poros de transição, ou até mesmo a inibição ou expressão de proteínas envolvidas na produção de EROs, a fim de compreender melhor a proteção exercida.
Palavras-chave: Citoproteção, doença de Parkinson, cultura de células, Plumbaginaceae.
Title: In vitro evaluation of Limonium brasiliense extracts in a rotenone induced
Parkinson's model in SH-SY5Y cells.
Abstract: The Parkinson’s disease (PD) is a chronic and progressive disease that affects millions of people in the world, there isn’t cure or delay treatment, only drugs that act on the symptoms of the disease. The aim of this study was to evaluate in vitro the cytotoxicity and cytoprotection of the Limonium brasiliense rhizome (Plumbaginaceae) using SHSY5Y human neuroblastoma strain in a Parkinson's disease model. From the crude extract (CE) produced with the rhizome L. brasiliense the ethyl acetate fraction (EAF) and aqueous fraction (AF) were prepared. The in vitro evaluation of the cytotoxic effect of rotenone and cytoprotective effect of the extracts were performed using human neuroblastoma cells, using the MTT technique, the detection of reactive oxygen species (ROS) was determined with H2DCFDA, the membrane integrity was determined by propidium iodide (PI), determination of mitochondrial transmembrane potential determined with rodamine 123 (Rh 123) and assessment of intracellular ATP levels with Cell Titer-Glo kit. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 9 software. In the cytotoxicity evaluation, rotenone has shown to significantly reduce cell viability at the concentrations tested (500, 1000, 1500 and 2000 nM), with 1702.11 nM being the concentration necessary to cause death in 50% of the cell population and used for cytoprotection tests. The fractions and CE, at concentrations of 1.95, 3.90 and 7.81 μg/mL, were able to significantly protect the SH-SY5Y neuroblastoma lineage against the damage caused by rotenone. Furthermore, it was possible to determine that CE and fractions significantly reduced the production of ROS when compared to rotenone, in addition to reducing membrane depolarization and maintaining cell integrity. In contrast, the samples weren’t able to increase the ATP levels reduced by rotenone. Thus, the electron transport chain linked to energy production would not be a possible target. The treatments evaluated were capable of inhibiting the damage to cells caused by rotenone, due to its antioxidant action by decreasing ROS. These results are satisfactory in context of the investigation of therapeutic options for the treatment of PD. However, complementary studies of the interaction of extracts with some mitochondrial membrane protein that prevents membrane depolarization and opening of transition pores, or even the inhibition or expression of proteins involved in the production of ROS, in order to better understand the protection exercised.
Keywords: Cytoprotection, Parkinson’ disease, cell culture, Plumbaginaceae.
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