2024 - Bárbara Longhini Gonzalez

MSc. Thesis

Autor/author: Bárbara Longhini Gonzalez

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - Universidade Estadual de Maringá

Data de Defesa: 13 de março de 2024

Orientador: Prof. Dr.  João Carlos Palazzo de Mello

Banca examinadora:  Profa. Dra. Naiara Cássia Gancedo

                               Prof. Dr. Paulo Wender Portal Gomes

Título: Análise do perfil fitoquímico da casca caulinar de Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville e avaliação da atividade cicatrizante em células L-929.

Resumo: O Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville é uma espécie de Barbatimão presente no Cerrado brasileiro, frequentemente utilizada por comunidades locais devido às suas propriedades anti-inflamatórias, antimicrobianas, antioxidantes e cicatrizantes. Estudos indicam que a atividade biológica dessa espécie está associada ao elevado teor de compostos fenólicos, predominantemente taninos, e diversos deles evidenciaram ação cicatrizante e anti-inflamatória. Para investigações sobre cicatrização in vitro, destaca-se a importância dos fibroblastos, fundamentais para manter a homeostase tecidual e cuja proliferação pode contribuir para a redução do tempo de cicatrização. O objetivo deste trabalho foi determinar a concentração adequada de extrato bruto (EB), fração acetato de etila (FAE) e fração aquosa (FAQ) de S. adstringens para avaliar sua atividade proliferativa e cicatrizante. Para identificar qualitativamente os taninos presentes na droga vegetal foram realizados testes com gelatina, cloreto férrico e reagente de Stiasny. O teor de polifenóis foi determinado por meio do reagente de Folin-Ciocalteu, com pirogalol como padrão. A quantificação de ácido gálico e galocatequina foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), conforme estabelecido pela sexta edição da Farmacopeia Brasileira. O EB foi obtido por turbo-extração a partir do pó da casca caulinar de S. adstringens, enquanto as frações foram obtidas por meio de partição líquido-líquido com acetato de etila e água. A caracterização e análise fitoquímica foi conduzida por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas. Os ensaios in vitro foram conduzidos em células fibroblásticas L-929. O ensaio de viabilidade celular foi realizado com o reagente brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio). A migração celular foi observada ao longo de 72 h e os registros fotográficos foram realizados a cada 24 h. Os rendimentos de extração foram de 32,54%, 31,50% e 71,65% para EB, FAE e FAQ, respectivamente. Foram obtidos para EB e FAE 375,845 ± 0,5503 e 340,306 ± 1,981 mg/g de EB/FAE ± DP equivalentes de pirogalol, respectivamente. As concentrações de ácido gálico e galocatequina quantificadas por CLAE foram de 0,363 ± 0,0565 e 1,069 ± 0,1563 (mg/g de droga vegetal), respectivamente. Dados espectrométricos sugerem a presença dos metabólitos fenólicos ácido gálico, galocatequina, epigalocatequina, 4'-O-metil-galocatequina, 4'-O-metil-epigalocatequina e epigalocatequina-3-O-galato, além disso foi constatada a presença de dímeros de prodeldinidina-prodelfinidina e prorobinetinidina-prodelfinidina. Nos ensaios in vitro, os tratamentos com EB e FAQ demonstram CC₅₀ superior a 125 µg/mL, enquanto a FAE exibiu uma CC₅₀ superior a 250 µg/mL. Observou-se uma maior taxa de proliferação celular em concentrações de 7,81 µg/mL para EB e FAQ, e de 15,62 µg/mL para FAE. Concentrações iguais ou inferiores a 15,62 µg/mL garantiram uma viabilidade celular acima de 100%, e a concentração de 7,81 µg/mL resultou em mais de 40% de fechamento de feridas in vitro em todos os tratamentos. Em suma, os três tratamentos desempenharam um papel significativo na indução de proliferação e cicatrização celular. No entanto, não foi observada diferença estatisticamente significativa (p>0,05) entre EB, FAE e FAQ na concentração e 7,81 µg/mL.

Palavras-chave: Cultura de células, Ferida, Fibroblasto, Proantocianidinas, Taninos.

Title: Analysis of the phytochemical profile of stem bark of Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville and evaluation of wound healing activity on L-929 cells.

Abstract: The Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville is a species of Barbatimão found in the Brazilian Cerrado, often utilized by local communities due to its anti-inflammatory, antimicrobial, antioxidant, and wound healing properties. Studies indicate that the biological activity of this species is associated with its high content of phenolic compounds, predominantly tannins, several of which have demonstrated wound healing and anti-inflammatory action. For in vitro wound healing investigations, the significance of fibroblasts is highlighted, as they are essential for maintaining tissue homeostasis and their proliferation may contribute to reducing wound healing time. The aim of this study was to determine the appropriate concentration of crude extract (CE), ethyl acetate fraction (EAF), and aqueous fraction (AQF) of S. adstringens to evaluate their proliferative and wound healing activity. Qualitative tests with gelatin, ferric chloride, and Stiasny reagent were conducted to identify the tannins present in the plant material. The content of polyphenols was determined using the Folin-Ciocalteu reagent, with pyrogallol as the standard. Quantification of gallic acid and gallocatechin was performed by high-performance liquid chromatography (HPLC), as established by the sixth edition of the Brazilian Pharmacopoeia. The EB was obtained by turbo-extraction from the stem bark powder of S. adstringens, while the fractions were obtained by liquid-liquid partitioning with ethyl acetate and water. Phytochemical characterization and analysis were conducted by liquid chromatography coupled with mass spectrometry. In vitro assays were performed on L-929 fibroblastic cells. Cell viability assays were conducted using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reagent. Cell migration was observed over 72 h, with photographic records taken every 24 h. Extraction yields were 32.54%, 31.50%, and 71.65% for CE, EAF, and AQF, respectively. CE and EAF were found to contain 375.845 ± 0.5503 and 340.306 ± 1.981 mg/g of CE/EAF ± SD equivalents of pyrogallol, respectively. The concentrations of gallic acid and gallocatechin quantified by HPLC were 0.363 ± 0.0565 and 1.069 ± 0.1563 mg/g of plant material, respectively. Spectrometric data suggest the presence of phenolic metabolites such as gallic acid, gallocatechin, epigallocatechin, 4'-O-methyl-galocatechin, 4'-O-methyl-epigallocatechin, and epigallocatechin-3-O-gallate, in addition to the presence of dimers of prodeldinidin-prodelfinidin and prorobinetinidin-prodelfinidin. In the in vitro assays, treatments with EB and FAQ demonstrated a CC₅₀ greater than 125 µg/mL, while FAE exhibited a CC₅₀ greater than 250 µg/mL. A higher rate of cell proliferation was observed at concentrations of 7.81 µg/mL for EB and FAQ, and 15.62 µg/mL for FAE. Concentrations equal to or lower than 15.62 µg/mL ensured cell viability above 100%, with 7.81 µg/mL resulting in over 40% closure of in vitro wounds in all treatments. In summary, all three treatments performed a significant role in inducing cell proliferation and wound healing. However, there was no statistically significant difference (p>0.05) observed between EB, FAE, and FAQ at a concentration of 7.81 µg/mL.

Keywords: Cell culture, Fibroblast, Proanthocyanidins, Tannins, Wound.

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